葉酸屬于維生素B復合體，是一種常見的水溶性維生素，因最早是從菠菜葉中提取純化而得，所以被命名為葉酸。

葉酸具有促進骨髓中幼細胞成熟的作用，同時參與不同酶系統中輔酶及嘌呤的合成，對DNA和RNA的合成十分重要。作為一種重要的營養素，在不同生理階段補給葉酸，能夠改善機體的生長性能和免疫機能，對動物機體的許多生理功能產生促進作用。

飼料中添加葉酸對維持母豬的繁殖性能和促進胚胎早期發育有著重要作用。研究表明，母豬日糧添加飼料級葉酸可提高胚胎存活率，穩定提高窩產仔數。

實驗部分：

預混飼料中葉酸的含量測定高效液相色譜法

【儀器與試劑】

儀器與設備：悟空K2025高效液相色譜儀；分析天平（精確到0.0001g）；渦旋振蕩器；

超聲波清洗機；離心機；容量瓶（100mL、1000mL，棕色帶刻度）。

試劑與材料：符合GB/T6682的一級水；甲醇(色譜級)；冰乙酸(優級純)；庚烷磺酸鈉(色譜純)；三乙胺(優級純)；無水碳酸鈉；0.45 μm濾膜；葉酸標準品(含量≥95.0%)。

【樣品前處理】

稱取試樣0.5 g（精確到0.001 g），置于100 mL棕色容量瓶中，加入約70 mL水、4 mL 2 mol/L碳酸鈉溶液，置于超聲水浴中超聲提取10 min，期間搖動2次；待冷卻后加水至約95 mL，再次檢查試樣溶液pH值，確認pH值為8～9，否則滴加少量碳酸鈉溶液調節；用水定容至刻度，搖勻。取部分試液離心5 min，取上清液過濾，待上機測定。

【色譜條件】

a）色譜柱: C18  4.6×150mm，5μm或者相當的色譜柱；

b）流動相：稱取1.1g庚烷磺酸鈉、50 mg EDTA溶于約1000 mL水中，加入20 mL冰乙酸、5 mL三乙胺混勻，用冰乙酸、三乙胺調節溶液pH值為4.0，過0.45 μm濾膜。取上述溶液800 mL與200 mL甲醇混合，備用；

c）柱溫：25℃；

d）進樣量：20μL；

e）流速：1.0 mL/min；

f）波長：282nm。

【結果與討論】：

1. 葉酸標準溶液色譜圖如圖1所示：

圖1葉酸標準溶液（5μg/mL）色譜圖

2. 將葉酸標準溶液逐級稀釋至信噪比S/N為3左右，計算儀器的檢出限，數據結果見表1。經計算儀器針對葉酸的檢出限為0.00939μg/mL，定量限為0.0313μg/mL。

表1靈敏度測試數據

3. 將系列葉酸標準溶液在HPLC上進行測定，繪制校準曲線，線性方程及相關系數見圖2，曲線的相關系數為0.99999，線性關系良好。

圖2葉酸標準溶液校準曲線

4. 購買市售的預混飼料作為樣品進行處理，并進行加標回收實驗，樣品加標回收色譜圖如圖3；經計算，此市售預混飼料樣品加標后葉酸含量為75.2 mg /kg，加標回收率為93.8%。

圖3 市售預混飼料加標回收色譜圖

【結論】

使用K2025高效液相色譜儀測定飼料中的葉酸含量具有良好的線性關系，確定系數R2為0.99999；連續進樣7針，標準品保留時間的RSD為0.084%，峰面積RSD為0.117%，定性、定量均有良好的重復性；儀器檢出限為0.00939μg/mL，定量限為0.0313μg/mL，完全滿足標準《GB/T 17813-2018 添加劑預混合飼料中煙酸和葉酸的測定 高效液相色譜法》針對飼料中葉酸含量測定的需求。