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              悟空高效毛細管電泳(HPCE)的免標記內成像(LFII?)技術分析對映體
              2020-03-11
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              應用說明

              對映體-小分子,CZE


              悟空高效毛細管電泳(HPCE)的免標記內成像(LFII®)技術分析對映體

              使用悟空高效毛細管電泳Peregrine系統和專利LFII®技術,成功地對堿性、中性和酸性藥物中的四對對映體進行了分析和解決,證明該系統能夠在峰遷移率(<0.1%RSD)和峰面積(<2.5%RSD)方面產生高質量的可重復數據。

              此外,在99.9%的其他對映體存在下,能夠檢測到含量0.1%的雜質RS阿替洛爾。

              簡介

              HPCE Peregrine系統上,使用悟空專有的免標記內成像(LFII®)技術對四組不同的對映體進行了分析。分析時,在緩沖液中加入高硫酸化環糊精(HSCD)。這使得對映體的分離在恒定條件下進行。在低pH下,電滲流(EOF)被抑制,并且負電荷CDs向陽極遷移。因此,對映體通過此系統與HSCDs疏水空腔相互作用。在低pH時,堿性化合物是強陽離子,因此與帶負電荷的CDs在疏水性和離子性上相互作用;而酸性化合物在低pH下質子化,因此只能作為具有疏水腔的中性物種。

              由于HSCDs的高導電性,會產生高電流,因此分離在內徑為25μm的裸石英毛細管中進行。有效的毛細管溫度調節對于防止焦耳加熱效應也非常重要。帕爾帖冷卻系統使用精確的熱設置。

              用毛細管區帶電泳(CZE),分析了酮洛芬(酸性)、華法林(中性)、丙醇和阿替洛爾(堿性),證明了悟空HPCE Peregrine毛細管電泳平臺的能力。

              材料和方法

              在內徑為25μm、有效分離長度為22cm、總長度為32cm的裸石英毛細管中對對映體進行分離。帶有Peregrine爾帖冷卻系統設置為22°C。所有樣品在運行緩沖液中制成,使用2 psi的壓力,注射時間為2s。反極性電壓模式下采用運行電壓為15kV。電泳在含有適當HSCD的專用緩沖液中進行。緩沖液在使用前脫氣。將樣品稀釋至25mM,調節磷酸緩沖液pH值為2.5。

              在兩次運行之間,用專用方法沖洗毛細管:先用無菌水沖洗1min,再沖洗毛細管2min,然后用運行緩沖液(包含合適濃度為5%沖洗2min,最后檢查連續性。所有數據均在214nm處采集。

              結果

              基于悟空HPCE Peregrine系統,利用等相位頂點算法(EVA)以及通用分離變換(GST)算法,對每對對映體進行快速有效地分離。GST是一種將512像素的數據以自然的方式組合起來的方法,它保留了像素的峰值形狀信息,同時使信噪比最大化。我們觀察到,與單一電泳圖相比,使用GST使信噪比增加了10倍。

              EVA是一種先進的模式識別工具,它最大化了系統的分辨率。定量信息是峰高而不是峰面積。在EVA中,首先分析電泳圖以找到局部峰值。這些用于執行頂點(確定原點),然后產生信號輸出。

              每對對映體的單像素原始電泳圖、GSTEVA處理數據如圖所示,從左到右分別為酮洛芬(酸性)、丙醇(堿性)、華法林(中性)和阿替洛爾(基本),對應圖依次為圖1、圖2、圖3和圖4。

              4 阿替洛爾單像素、GSTEVA數據的比較

              使用悟空HPCE PeregrineLFII®系統證明了對映體的重現性。根據GST數據,峰移時間和峰面積計算重現性,分別如表1和表2所示。

              1 每對對映體峰遷移時間的GST重現性(基于峰1


              5顯示了對存在于阿替洛爾R對映體中微量的阿替洛爾S對映體的分析?;舅幬镏?/span>S-型占R-對映體的0.1%,而圖6顯示了R-型濃度(作為S-型的百分比)與觀察到的峰面積百分比的關系圖。

              5R-阿替洛爾中含有0.1%S-阿替洛爾的GSTEVA

              6S-阿替洛爾中含有0.1%R-阿替洛爾的GSTEVA

              結論

              具有LFII®檢測的悟空HPCE Peregrine系統已成功應用于手性分析,展示了對對映體的快速有效分離。卓越的分辨率在四組對映體之間進行了驗證,具有較高的重現性。峰面積與濃度之間具有良好的線性關系,定量為0.1%的對映體是主要的存在形式。在運行緩沖液中加入適當的高硫酸化環糊精,可以解決多種對映體混合物,如酸性、中性和堿性藥物的分析。

              GST數據顯示了令人印象深刻的信噪比的增加,以及對映體顯著的分辨率,而EVA處理的數據顯示了兩個峰的分辨率的顯著提高。

              這證明了Peregrine系統對對映體強大的分離能力,特別是使用悟空EVA信號分析數據時。

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